Зберігання гамет

 ТЕМА. ЗБЕРІГАННЯ ГАМЕТ

МЕТА ЗАНЯТТЯ  вивчити основні поняття  та технології заморожування ембріонів.

ЗАВДАННЯ  проведення заморожування ембріонів за різних технологій

Нетривалий строк зберігання сперми зумовлює великі труднощі в роботі станції і пунктів штучного осіменіння.

Теоретичні міркування показують, що продовжити строки зберігання сперми можна способом подальшого зниження температури зберігання. Проте вже при температурі -0,6^оС сперма починає замерзати і спермії гинуть  ( http://intersono.ua/kriotsykly_ta_kriokonservatsiya/).

Основна причина загибелі клітин - кристалічне замерзання води. Кристали льоду, які утворюються в протоплазмі сперміїв, викликають пошкодження її тонкої структури.

Другою причиною загибелі сперміїв, є згубна дія концентрованих розчинів цукрі і солей, які утворюються в рідкій фазі сперми - плазмі внаслідок вимерзання води на початку охолодження сперми.

Дуже велике значення має режим охолодження сперми при її заморожуванні. І в даний час використовують два режими замороження :

1 - швидке заморожування малих об'ємів сперми в вигляді гранул, або поліетиленових чи полістиролових трубочках - капілярах;

2  - більш повільне замороження в поліетиленових чи скляних ампулах. Теоретичною основою швидкого замороження сперми є гіпотеза про

можливість склоподібного некристалічного затвердіння - вітрифікація біологічних об'єктів, в тому числі сперми.

Щоб, зрозуміти як можна досягти вітрифікації клітин, треба пригадати як відбувається процес кристалізації води при замерзанні. В охолоджувальній воді утворюються зародкові центри кристалізації - скупчення молекул з малою кінетичною енергією. В'язкість води яка зростає із зниженням температури, знижується тепловий рух молекул, але потім починають перешкоджувати переміщенню молекул у рідині, що необхідно для утворення „кристалічної решітки". Тому при подальшому зниженні температури швидкість кристалізаційних процесів знижується і нарешті майже падає до нуля.

Нижня межа при температурному інтервалі, в якому інтенсивно відбувається кристалізація, досі точно не визначена. При замороженні сперми вона зберігається в інтервалах - 40° - 50°С.

Якщо сперму охолоджувати повільно, то вся вода яка находиться в ній, встигне за кристалізуватися і спермії загинуть;

Проте при швидкому охолодженні; і за теорією Лайта, вдається     «проскочити» небезпечну температурну зону кристалізації і досягти зони вітрифікації де протоплазма сперміїв застигає як одне ціле, без вимерзання і без утворення льоду, при цьому зберігається тонка структура протоплазми і ядра;

Висока швидкість охолодження досягається лише до певних умов:

1-           треба охолоджувати дуже малі об'єми (0,1 - 0,15 мл) при заморожуванні більш великих об'ємів, швидкість зменшується і вода в спермі перетворюється на кристалічний лід;

2 -     необхідні охолоджувачі з низькою температурою; використовують: - рідкий азот -196°-р  ідкий кисень -183°, так як він підтримує горіння

-               твердий двуокис вуглецю (сухий лід), але його не використовують в наслідок високої температури випаровується (- 78°) ця температура лежить недалеко від нижньої межі зони кристалічного замерзання; 4- склоподібний стан нестійкий.

За умов підвищення температури зберігали у вітрифікованій спермі може почати утворюватись кристали - девітрифікація.

Щоб не допускати цього сперму потрібно зберігати при t° нижче за - 100°С і не допускати навіть короткочасних підігрівання.

Розморожувати сперму потрібно швидко, щоб пройти через небезпечну температурну зону кристалізації води, щоб не встигли утворитись кристали льоду і сперми безпосередньо з склоподібного стану переходить в рідкий.

При не занадто швидкому (але й не надто повільному) охолоджуванні сперми починається кристалізація так званої вільної води у її рідкій фазі (плазмі).

Поміж кристалами льоду навколо сперміїв утворюються концентрований розчин цукрів і солей, під дією якого з клітин витягується вільна вода. Спермії при цьому не гинуть, оскільки за низьких температур вони менш чутливі до гіпертонічних розчинів, ніж за плюсових. Втрата вільної води зменшує можливість утворення кристалів усередині клітин і сприяє вітрифікації протоплазми.

Отже, кажучи про можливість вітрифікації сперми, яка зберігається в рідкому азоті, слід оберігати від підвищення температури. Для цього необхідно своєчасно доливати рідкий азот у посудину, де зберігається сперма, і якнайрідше витягати з них мішечки або каністри з спермою: при кожному такому взятті температура сперми може підвищитись.

Підвищення швидкості відтаювання замороженої сперми збільшує кількість сперміїв, які відновлюють нормальний рух. Очевидно, в цьому випадку вдається уникнути рекристалізації протоплазми сперміїв.

Усі існуючі методи глибокого замороження сперми передбачають попереднє повільне охолодження (протягом 3-4 год) від кімнатної температури до 2- 4°С та витримування при цій температурі протягом деякого часу так звана адаптація сперміїв. Значення адаптації полягає в тому, що спермії при температурі близько 0°С переходять у стан неповного анабіозу і легше переносять осмотичні зміни в процесі заморожування, ніж у тому випадку, коли обмінні процеси відбуваються на високому рівні. Крім того, якщо починати процес глибокого охолодження сперми при кімнатній температурі, а при нульовій, скорочується час перебування сперми в рідкому стані, а отже, зменшується небезпека холодового удару, який спостерігається тільки в рідкій спермі.

Втрати сперми неминучі, коли її зберігають іншими способами, і майже повністю усуваються при замороженні.

Тепер досить досконало розроблено техніку заморожування сперми бугаїв і ведуться успішні юсліди із заморожування сперми жеребців, баранів, кнурів.

ПИТАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ:

1.Поняття про вітрифікацію;

2.Поняття про девітрифікацію;

3. Завдяки чому досягається висока швидкість охолодження.