ТЕМА. ТРАНСПЛАНТАЦІЯ ЕМБРІОНІВ РЕЦИПІЄНТАМ

МЕТА: засвоїти основні поняття про трансплантацію ембріонів.

ЗАВДАННЯ: Вивчити науково-теоретичний аспект, прикладне значення та порядок проведення трансплантації ембріонів реципієнтам.

Прикладне значення та фізіологічні основи трансплантації ембріонів

Під трансплантацією ембріонів розуміють перенесення зиготи з рогів матки високо цінних тварин – донорів в роги матки низько продуктивних тварин -реципієнтів, з подальшим розвитком у останніх вагітності і народженням телят, що мають генетичний потенціал батьків – донорів.

Трансплантація ембріонів - єдиний і незамінний шлях виходу досягнень ембріоінженерії в практику тваринництва ( http://www.embryokpc.net/index.php?option=com_content&view=article&id=9:2008-06-29-21-31-30&catid=4:2008-06-30-04-18-36 ) .

В найпростішому виконанні метод трансплантації ембріонів значно переважає за результативністю метод штучного осіменіння тварин і дозволяє в 3-4 і більше разів прискорити генетичний прогрес в молочному стаді.

Рис. 10. Використання біотехнологічних методів у тваринництві

Однією з основних задач біотехнології в тваринництві є збільшення швидкості відтворення потрібних генотипів, в першу чергу шляхом отримання плідників від високоцінних в селекційному відношенні батьків. Особливо велике значення має отримання високоцінних бугаїв-плідни-ків. В провідних країнах світу 60% бугаїв-плідників, що використовуються для штучного осіменіння отримані методом трансплантації.

В молочному скотарстві від однієї корови можна отримати бугая-плідника на протязі 2-х років. Використовуючи трансплантацію ембріонів: 2-5 голів і більше на рік, а застосувавши мікрохірургічний поділ ембріонів - в півтора рази більше.

Трансплантація ембріонів з успіхом проводиться у більшості лабораторних тварин, приматів, сільськогосподарських тварин. Найбільш широко цей біотехнологічний метод використовується в скотарстві і козівництві.

Історія трансплантації ембріонів, як інструментального методу біологічних досліджень починається з квітня місяця 1890 року. В Кембриджському університеті Уолтер Хіп від крільчихи отримав перших крільчат трансплантатів.

На початку 50 років 20 століття А.В. Квасницький в ВНДІ свинарства отримав перших в світі поросят-трансплантатів.

Перше теля після хірургічної трансплантації було отримано в США у 1951 році, а в 1964 не хірургічним.

В останній період внаслідок недостатнього рівня виробництва та високій вартості трансплантації ембріонів використання цього методу не завжди економічно виправдано.

Аналіз різних способів організації трансплантації ембріонів, безпосередньо в господарствах, показав, що собівартість одного життєздатного ембріона становить приблизно 225 грн., однієї тільності – 550 грн. (у цінах 1998 р.)

Трансплантація в межах одного виду називається алло- або гомотрансплантацією.

На відміну від трансплантації органів і тканин ссавців, що супроводжується тканинною несумісністю, при пересадці ембріонів від донорів до реципієнтів таких явищ не виникає.

Це пов'язано з тим, що порожнини яйцепроводів матки донорів і реципієнтів імунологічно толерантні, і до початку імплантації ембріонів, тобто до безпосереднього контакту хоріона ембріона і слизової оболонки, проходить деякий час (7-16 днів у різних видів тварин).

Реципієнт не впливає на генотип плоду. Однак, ”прийомна мати” впливає на процеси розвитку і росту плоду, на його масу при народженні, а також на стійкість новонароджених до захворювань.

Метод трансплантації ембріонів дозволяє отримувати більшу кількість однорідного потомства від високопродуктивних тварин та цінних генотипів, швидко і широко розповсюджувати рідкісні і зникаючі породи, прискорено створювати високопродуктивні селекційні стада, інтенсифікувати розмноження молочного поголів’я шляхом пересадки зародків відомої статі, збільшувати вихід телят шляхом пересадки двох ембріонів з метою отримання близнюків, створювати банк ембріонів і накопичувати генетичний матеріал з метою наступного транспортування і трансплантації у заплановані стада тощо (http://ua-referat.com/Групи_крові_і_трансплантація_ембріонів ).

Купівля ембріонів чистопорідних тварин дає можливість отримати відносно дешеву генетику високого класу, яку неможливо отримати у вигляді живої худоби.

Однією із умов ефективного використання методу є організація і добре обладнання центрів і пунктів з трансплантації ембріонів.

Підприємства з трансплантації ембріонів відноситься до об'єктів закритого типу. Територія повинна мати чітко відокремлені три зони: «А», «Б», «В». У зоні «А» розміщується лабораторно-технічний бокс з складом ембріонів.

В зоні «Б» знаходяться приміщення для утримання донорів, реципієнтів і народжених трансплантантів. Зона «В» є умовно відкритою. Тут розміщуються приміщення господарсько-побутового призначення: адміністративний корпус, транспортний цех, котельна тощо.

В господарстві приміщення з трансплантації ембріонів розташовують поблизу місць утримання тварин, що використовують як донорів і реципієнтів, його можна будувати разом з тваринницькими приміщеннями.

Лабораторно-технологічне приміщення повинно мати окремий вхід для персоналу, манеж для санітарної обробки тварин перед операцією, операційну, передопераційну, стерильний бокс з передбоксником для первинної обробки ембріонів, приміщення для заморожування і зберігання ембріонів, комору для зберігання препаратів і реактивів, кімнату для персоналу і санвузол.

Пункти з трансплантації ембріонів є цехами сільськогосподарського підприємства і створюються в державних племінних заводах, племінних господарствах, племінних фермах, експериментальних дослідних і учбово-дослідних господарствах.

Фактори, що впливають на ефективність трансплантації

На результат трансплантації ембріонів впливає чимало факторів, які тісно взаємопов'язані між собою, що їх неможливо розділити по значенню.

1. Технічні прийоми проведення трансплантації (хірургічний, не хірургічний).

2. Вік ембріона та його розміри.

3. Рівень синхронності статевих циклів.

4. Пора року.

5. Кваліфікація оператора.

6. Місце введення ембріону.

7. Умови та тривалість культивування ембріонів в проміжку між вимиванням і пересадкою.

8. Індивідуальність донора.

В основі технологічних рішень трансплантації лежать загально біологічні відомості щодо нервово-гормональної регуляції статевої функції, запліднення, внутріутробного розвитку зиготи ( http://www.propozitsiya.com/?page=149&itemid=2504&number=80 ).

Однією з головних умов одержання якісних ембріонів та добре розвиненого життєздатного потомства є науково-обґрунтована годівля та утримання донорів і реципієнтів.

Тому їх відокремлюють від основного стада, забезпечують повноцінну годівлю, активний моціон, відповідний мікроклімат та спостерігають за проявом статевих циклів.

Етапи трансплантації ембріонів та їх характеристика

Метод трансплантації ембріонів складається з двох важливих взаємопов’язаних ланок біотехнологічного процесу, а саме: стимуляції суперовуляції у донорів та пересадження ембріонів реципієнтам.

Незважаючи на спосіб трансплантації ембріонів технологія складається з наступних операції (http://chitalky.ru/?p=824):

2. синхронізація статевих циклів донора та реципієнта (якщо немає можливості кріокосервувати зиготи);

6. пошук, оцінка та маніпулювання з зародками;

7. пересадка зародків реципієнту або їх заморожування.

Донорів відбирають виходячи з мети трансплантації, переважно після 1-2-х нормальних родів, серед реагуючих суперовуляцією тварин, з господарств благополучних по інфекційних та інвазійних хворобах. Також враховують продуктивність і повноцінність статевих функцій.

На кожну тварину оформляється ветеринарне свідоцтво (форма № 1) із зазначенням клінічного стану здоров'я і результатів досліджень на бруцельоз, туберкульоз, лейкоз, вірусні респіраторні захворювання, трихоманоз, вібріоз, інфекційний пустульозний вульвовагініт, ящур (з урахуванням виду тварин).

Тварини з порушенням перебігу вагітності, родів, післяродового періоду і статевих циклів не підлягають апробації на донорство.

В групи донорів відбирають корів, які мають репродуктивний вік 3-7 років, надій за лактацію 9-10 тис. кг та добре реагують на гормональну обробку. Враховується повноцінність і ритмічність статевих циклів, плодовитість, перебіг вагітності і родів.

На сьогодні відпрацьовано два варіанти використання високоцінних корів рекордисток на пунктах по трансплантації ембріонів:

- в найбільш високопродуктивних корів після отелу проводять один курс вимивання ембріонів, а в наступну охоту їх штучно осіменяють і переводять для використання в основному стаді;

- корів рекордисток після виранжування вибраковують з основного стада і переводять на пункт в якості постійного донора ембріонів.

При підборі реципієнтів виходять з таких вимог: можливість нормальних родів, економічний ефект, не розповсюдження інфекційних хвороб, можливість приживлення ембріонів.

Реципієнтами вважають тих самок, яким пересаджують чи підсаджують ембріони. їх частіше відбирають із фізіологічно зрілих молодих самок.

Для забезпечення можливості нормальних родів відбирають тварин репродуктивного віку (3-7 років), телиць фізіологічної зрілості вік 16-18 міс. і живою масою 330-340 кг і більше.

Економічний ефект від трансплантації ембріонів досягається при різниці потенціалу продуктивності донора і реципієнтів не менше 220 %.

З метою запобігання розповсюдження інфекційних та інвазійних хвороб реципієнтів досліджують за тими ж показниками, що й донорів.

Тварини, що мають порушення статевих циклів, морфологічні зміни в статевих органах як реципієнти не використовуються.

Доцільно підбирати реципієнтів серед малопродуктивних, аборигенних тварин. Чим більша різниця в продуктивності донора і реципієнта, тим більший економічний ефект трансплантації. Вважається, що реципієнти не впливають на генотип приплоду, але повноцінне формування організму, несприйнятливість до захворювань приплоду цілком залежить від організму реципієнта.

Реципієнтів, як і донорів, відбирають в благополучних по інфекційних та інвазійних хворобах господарствах після діагностичних досліджень і карантину.

Синхронізація статевої охоти у донорів і реципієнтів — це приведення організмів цих тварин до однакового нервово-гуморального стану відносно дня статевого циклу.

Як правило, реципієнтів синхронізують з донорами. Основною умовою успішного приживлення зародків є синхронний прояв охоти у донора і реципієнта. Різниця в проходженні охоти в донора та реципієнта не повинна перевищувати ± 1 добу.

Кращі результати отримують при абсолютному збіганні в часі охоти донора і реципієнтів. Однак цього досягти досить важко.

Синхронізація буває природною і штучною. Природною синхронізація буде в тому випадку, якщо статева охота і осіменіння у донора зберігається із спонтанною охотою у реципієнта.

При штучній синхронізації статева охота реципієнтів викликається введенням простогландинів (естрофан, суперфан ін.) і лізисом жовтого тіла. На кожного донора відбирають від 6 до 10 реципієнтів, оскільки частина з них не дає необхідної реакції на гормональну обробку.

Синхронізацію статевого циклу донора і реципієнта можна проводити за наступною схемою:

10-21 день – естрофан по 500 мкг; тривітаміни по 15 мл.

Суперовуляція — множинна овуляція, досягається провокуванням дозрівання багатьох третинних фолікулів і виходом з них овоцитів ІІ порядку.

Суперовуляція рахується досягнутою, якщо пройшло виділення шести і більше овоцитів ІІ порядку.

Для провокування суперовуляції використовують різні гормональні препарати, що мають фолікулостимулюючу активність (КЖК, СЖК, ФСГ, графолон, фолікотропін та ін.).

У корів та телиць стимуляція суперовуляції досягається використанням гонадотропінів гіпофізарного і плацентарного походження.

При гормональній обробці донора необхідно пам’ятати, що із збільшенням числа овуляцій запліднювальність знижується. Тобто між кількістю введеного гормону і числом овуляцій існує пряма залежність, а між якістю отриманих клітин зворотна.

Для викликання суперовуляції в більшості домашніх тварин використовують гонадотропін сиворотки жеребих кобил (ГСЖК). В препараті міститься фолікулостимулюючий (ФСГ) і лютеінізуючий гормони (ЛГ).

День статевого циклу	Послідовність роботи та препарати	Доза препарату
0	Вітамін А	150000 М.О.
	Вітамін Е	100 мг
	Йодистий калій	100-200 мг
10-12	ГСЖК	2500-3000 ІО
	Вітамін А	7500 МО
	Вітамін Є	50 мг
12-14	Через 48 год. Простагладін (ПГР₂)	30 мг або 500 мкг
14-16	Охота і осіменіння
21-23	Вимивання ембріонів та їх пересадка
24-26	Простагладін (ПГР₂)	30 мг або 500мкг

Введення препарату стимулює швидкий розвиток багатьох фолікулів на протязі 3-5 днів після обробки.

Препарат ГСЖК підвищує в плазмі рівень естрогенів, що є однією з причин швидкого прояву охоти. За “

0” день циклу приймають день спонтанної повноцінної охоти. В цей день проводять дослідження статевих органів і вводять внутрім’язово вітаміни.

Осіменіння донорів може проводитись як природно, так і штучно. Плідників відбирають за такими ж вимогами, як донорів і реципієнтів. Найкращі наслідки осіменіння корів-донорів одержуються при застосуванні ректо-цервікального способу осіменіння. Доза сперми (в зв’язку з множинною овуляцією) збільшується проти загальних правил в три - чотири рази і проводиться до припинення проявів статевої охоти. В розмороженій спермодозі повинно міститися 45-75 млн. сперматозоїдів з прямолінійно поступальним рухом, при цьому активність сперми має бути не менше 4-х балів, а для бугаїв-плідників поліпшувачів 3-и бали.

Застосовування ректо-цервікального способу штучного осіменіння дозволяє перед введенням катетера в шийку матки контролювати стан статевого апарату донора, яєчників, наявність в них фолікулів.

Дотримання існуючих правил штучного осіменіння донора дозволяє отримати високий відсоток запліднення та одержати високоякісні ембріони.

На сьогодні ембріонів від донорів одержують хірургічним і нехірургічним методами. Порівняльна оцінка показала, що хірургічний спосіб більш ефективний з точки зору абсолютної можливості одержання ембріонів. Однак необхідно відзначити, що післяопераційні ускладнення – спайки - не дозволяють використовувати донорів і реципієнтів більше трьох раз. Вимивання ембріонів проводять на 6 - 8 - й день після штучного осіменіння ( http://works.tarefer.ru/12/100055/index.html).

Головні переваги нехірургічного вимивання ембріонів полягають в відносній простоті виконання, без особливого ризику втрати репродуктивної здатності донорів і повторного їх використання. Цей метод не потребує спеціального операційного приміщення, що дозволяє успішно застосовувати його безпосередньо на тваринницьких фермах.

При нехірургічному методі отримання ембріонів корову донора фіксують в станку. Пряму кишку звільняють від вмісту і проводять ректальне дослідження. Визначають кількість жовтих тіл в кожному яєчнику. Для припинення перистальтики прямої кишки епідурально вводять 10 мл 2% розчину новокаїну. На сьогодні для вимивання широко використовується гнучкий катетер Фолея. Катетер складається з трубки, кінець якої - робоча частина - мас надувний балончик і 4-6 отворів, які забезпечують введення і виведення промивного середовища (рис. 12).

Рис. 12. Катетер для вимивання зародків Фолея: 1- корпус катетера; 2- стилет; 3 – трубка для накачування повітря; 4 – балончик для повітря

Катетер надівають на стальний стилет (2) і під ректальним контролем вводять в піхву по верхньому склепінню до шийки матки. Обережними рухами натягують шийку на катетер і просувають його по каналу шийки до біфуркації, а потім в один з рогів матки. Коли катетер доходить до великої кривизни рогу матки, стилет поступово видаляють по мірі просування катетера до верхівки рогу. Перевіривши розміщення катетера в розі матки і ступінь перекриття балончиком рогу з катетера виводять стилет.

В балончик катетера (4) накачують 10-15 мл повітря. При цьому катетер фіксується в рогові матки, а промивна рідина не витікає повз нього.

Закріпивши катетер, промивають порожнину рога матки з допомогою шприца фосфатно-буферним сольовим розчином Дюльбекко.

Посуд для збору рідини з ембріонами розміщують в термоізолюючий матеріал, а флакон з промивною рідиною закріплюють вище висоти донора - 190 - 200 см. Промивну рідину вводять в верхівку рога за допомогою шприца ємкістю 60 і більше мл, або самопливом і перекривають зажимом трубку.

На промивання кожного рогу матки використовують не більше 500 мл розчину. Суворо контролюють кількість введеної і зібраної промивної рідини. По закінченню вимивання з балончика катетера випускають повітря і, витягнувши катетер, ще раз ретельно промивають систему, щоб змити ембріони з стінок. Можна не виводити катетер назовні, а довести його до біфуркації і знову вставивши стилет, завести в другий ріг матки, аналогічно вимивають і другий ріг ( рис. 13).

Рис. 13. Отримання зародків нехірургічним способом: 1 – катетер для отримання зародків; 2 – шийка і 3 – ріг матки; 4 – надувний

Для санації в матку після вимивання вводять суміш антибіотиків - пеніцилін + стрептоміцин по 500 тис. ІО в 20 мл 0,5% розчину новокаїну.

Хірургічне отримання ембріонів проводять під місцевим, або загальним наркозом. Розрізають черевну стінку по білій лінії, а частіше в області голодної ямки справа або з ліва, підтягують ріг матки до поверхні рани, роблять розріз близько до основи і вставляють спеціальний катетер. Потім через голку, введену в порожнину рога в його верхушки вводять спеціальне середовище, яке разом з зародками збирають через катетер. При цьому методі збирають до 70% життєздатних зародків. На результат при хірургічному методі впливають: характер наркозу; метод розрізу черевної стінки.

Однак хірургічний метод, на думку багатьох спеціалістів, має тільки наукове значення. Даний спосіб трудомісткий, вимагає багато затрат і може привести до безпліддя донора.

На етикетку ємкості з ембріонами наносять інформацію - правий чи лівий ріг, кількість жовтих тіл на яєчнику з цього боку, час закінчення вимивання, і ємкість залишають на відстоювання. Кількість жовтих тіл на яєчнику повинна дорівнювати кількості одержаних ембріонів

Пошук, оцінка та маніпулювання з зародками

Зібрану в циліндр рідину відстоюють 20-35 хв. в термостаті при температурі 37⁰С, щоб зародки осіли на дно. Після чого верхню частину відсмоктують за допомогою сифону, залишаючи 50-100мл рідини.

Якщо в промивальній рідині багато слизу і крові, то до неї додають розчини для вимивання ембріонів. Після додавання розчину осадок гомогенізується ї його центрифугують на протязі 3-5 хв. при 3-5 тис. обертів/хв. Рідину що залишилась виливають в чашки Петрі на дно котрих для зручності пошуку розкреслено на квадрати 1×1 см.

Для проведення дослідження рідину чашки Петрі кілька разів коливають по колу, щоб виявити ембріони, які прилипли до стінок.

Знайдені ембріони піпеткою Пастера переносять на стерильні годинникові скельця або малі чашки Петрі з поживним середовищем для короткочасного зберігання ембріонів (рідина для промивання +20% фетальної сироватки крові теляти, вівці чи оленя).

За Харківською технологією, з метою прискорення пошуку ембріонів, пропонується промивну рідину одразу збирати в одноразові конусоподібні поліетиленові ємкості, які підвішують на штатив на 20 хвилин для осідання (седиментації) ембріонів. По закінченню осідання нижню частину ембріопри-ймача перепаюють термозажимом і ножицями відрізають від приймальної ємкості.

За англійською технологією промивна рідина під час вимивання одразу проходить через ємкість з ситечком, діаметр отворів якого 90-100 мк, тому ембріони лишаються и ємкості, їх розмір коливається від 130 до 150 мк. Тому відпадає потреба відстоювати промивну рідину протягом 20 хвилин, а зразу починається пошук

Ембріони отримують на стадії пізньої морули або ранньої бластули.

Робота по пошуку і оцінці ембріонів проводитися в спеціальному стерильному боксі при температурі 25 - 26°С.

Якість ембріонів визначають наступними методами:

- прижиттєве фарбування з використанням люмінесцентних фарбників;

- культивування за межами організму на протязі 24-48 год.

Морфологічну оцінку якості ембріонів проводять під мікроскопом або бінокулярною лупою при 100-150-кратному збільшенні. Визначають стадію розвитку ембріонів (незапліднені яйцеклітини, ранні та пізні морули і бластоцити), а також їх якість (відмінні, добрі, задовільні, умовно придатні, непридатні) (рис. 14).

Рис. 14. Зародки великої рогатої худоби (1, 2) і свиней (3, 4) придатні для трансплантації

Відстаючі від нормального розвитку ембріони з ознаками асинхронності дроблення бластомерів, їх дегенерації - непридатні для трансплантації. Ембріони з невеликими морфологічними змінами вважаються умовно придатни-ми. Однак не завжди вдається точно визначити повноцінність 7-8 денних ембріонів, внаслідок їх незначних розмірів. Дегенерація ембріонів починається ще на стадії просування їх по яйцепроводу, але морфологічно це проявляється на більш пізніх стадіях, коли вони опиняються в розі матки (табл. 5)

Важливо вірно оцінити вимиті ембріони. Однак на основі морфологічної оцінки не можна зробити остаточне заключення про їх життєздатність. Все залежить від їх розвитку в процесі культивування і приживлення в розі матки реципієнта.

Прижиттєва оцінка ембріонів з використанням барвників базується на різних ступенях проникнення барвників через прозору оболонку живих або мертвих ембріонів. Для фарбування використовують флюоресцеїн діацетат (ФДА), 4,6-диаміно-2-фенілліндол та інші.

Прижиттєву оцінку ембріонів проводять таким чином: його розміщують на предметному склі, додають відповідний барвник, проводять інкубацію і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. Живі ембріони дають червонувате свічення, мертві - зелене.

Оцінка життєздатності ембріонів методом культивування. Біологічно повноцінні ембріони при створенні оптимальних умов культивування продовжують свій розвиток. В якості поживного розчину використовують середовища: ТС - 199, сольовий розчин Дюльбекко та інші з різними біологічними і синтетичними добавками. Осмотичний тиск середовищ чи розчинів повинний бути 300 міліосмолей, рН - 7,2-7,4.

Культивування ембріонів проводить у поживному середовищі в годинникових скельцях. На яке переносять піпеткою 25 крапель стерильного вазелінового масла, після цього шприцом з тонкою голкою підпускають під вазелінове масло 0,1 мл поживного середовища. Годинникове скельце розміщають в чашки Петрі і встановлюють в ексикатор, який ставлять в термостат при температурі 37° С. Протягом 10 20 хвилин через ексикатор пропускають газову суміш, яка має 90 % азоту, 5 % вуглекислого газу і 5 % кисню. Після цього з годинникових скелець, що знаходяться в ексикаторі, шприцом видаляють поживне середовище і в свіжій порції поживного середовища поміщають ембріон під вазелінове масло чашки Петрі з годинниковими скельцями знову переносять в ексикатор при 37°С і знов пропускають газову суміш, попередньо фільтруючи і зволожуючи її. Ексикатор щільно закривають, шланги для вводу газової суміші герметично перекривають зажимами і залишають в термостаті на період інкубації. Для контролю за рН в ексикатор ставлять бюкс з поживним середовищем, в яке додають індикатор феноловий червоний. При рН 7,2 - 7,3 феноловий червоний в розчині має оранжево-червоний колір. При залужуванні колір контрольного середовища буде малиновим, при закисленні - оранжевим.

Культивування ембріонів в репродуктивних шляхах проміжного реципієнта (in vivo) для транспортування і після реконструкції ембріона. Проміжним реципієнтом може бути вівця або лабораторна тварина (кролі, миші), тому що передімплагаційний ембріон толерантний до чужорідного середовища гетерогенного реципієнта.

Кращим місцем репродуктивного тракту проміжного реципієнта є яйцепровід. Зберігати ембріони можна на протязі такого часу, який вони знаходяться в природних умовах, не пізніше денудації. Знаходячись в яйцепроводах реципієнта, ембріони продовжують розвиток, але він може бути повільнішим у порівнянні з нормою. Ці обставини необхідно враховувати при виборі ступеня синхронізації кінцевого реципієнта.

Техніка підготовки проміжного реципієнта не складна. Перед введенням в яйцепровід ембріонів, його перев'язують поблизу матково-трубного з'єднання. В кожний яйцепровід можна пересадити звичайним способом до 25 ембріонів в невеликій кількості поживного середовища.

Відстаючі від нормального розвитку ембріони з ознаками асинхронності дроблення бластомерів, їх дегенерації - непридатні для трансплантації.

Незапліднені яйцеклітини мають правильні сфери, прозорий перивітеліновий простір, гомогенне розміщення цитоплазматичних тілець. Дегенеративні незапліднені яйцеклітини відрізняються деформацією прозорої оболонки; цитоплазма інколи займає весь перивітеліновий простір, відбувається зміщення ядра до одного з полюсів або периферії, нагадуючи ранню 7-денну бластоцисту.

Морула являє собою скупчення бластомерів не завжди однакових за розмірами із-за асинхронного дроблення. Цитоплазма гомогенна, бластомери мають полігональний зв'язок. Перивітеліновий простір вільний від гранул і включень.

Оцінка ембріонів з використанням люмінесцентних фарбників ґрунтується на різному ступені проникнення фарбників через прозору оболонку живих і мертвих ембріонів. Для фарбування використовують акридиноранж (АО), флуоресцеіндіацетат (ФДА), 4,6-діаміно-2-феніліндол (ДАШ), 2,7-діаміно-10-етіл-9-фенілфенантри-діум бромід (ЕБ), 1-аніліно-нафталін-8-сульфанат (1,8-АНС).

Акридиноранж готують на розчині Локка в концентрації 1 : 40000. Ембріони з рідиною розміщують на предметному склі і додають фарбник. Інкубацію ембріонів проводять на протязі 10 хв. при кімнатній температурі в темноті, після чого фарбник змивають розчином Локка і накривають покривним склом. Оцінку життєздатності проводять під люмінесцентним мікроскопом на протязі 1,5 хв. Живі клітини набувають червонуватого відтінку, а мертві — зеленуватого.

Оцінку ембріонів методом культивування проводять виходячи з того, що в біологічно повноцінних ембріонів при оптимальних умовах продовжується розвиток. Для культивування ембріонів застосовують поживні середовища: ТС-199, сольові розчини Дюльбекко з різними біологічними і синтетичними добавками.

Осмотичний тиск поживних середовищ повинен бути близько 300 міліосмолей, рН 7,2—7,4. Культивують ембріони в чашках Петрі в краплях поживних середовищ на годинникових скельцях під шаром вазелінового масла, і витримують їх у газовому середовищі, яке містить 90 % азоту, 5 % кисню, 5 % двооксиду вуглецю.

Більш простий спосіб - культивування ембріонів в пробірках і соломинах. Ембріони переносять в пробірку з 1 мл поживного середовища і після додавання трьох крапель вазелінового масла закривають алюмінієвою фольгою. Ембріони можна культивувати на протязі 95 год.

Клонування ембріонів – отримання ембріонів від одного ембріона в наслідок мітотичного поділу. Клон – популяція клітин або особин, що походять від одного з предків шляхом безстатевого розмноження.

Розмноження цінних генотипів сільськогосподарських тварин, перш за все одноплідних, дозволить значно прискорити, впровадження в практику трансплантації поділ ембріонів. Ділення 7-ми добових ембріонів великої рогатої худоби на стадії пізньої морули і ранньої бластули дозволяє отримати більше телят від отриманих у донора ембріонів внаслідок високого привиття половинок в порівнянні з рівнем привиття цілих ембріонів.

Рис. 16.Мікрохірургічний поділ пізньої морули

Відсоток тільностей реципієнтів при пересадці цілих ембріонів становить 64, а при трансплантації половинок (по одній на реципієнта) – 74,6%.

Поділ ембріонів дозволяє отримати монозиготних близнюків.

В наслідок введення в прозору оболонку двох і більше половинок зародків можна отримати хімерні ембріони.

Рис. 19 Введення половинок прозору оболочку

Рис. 20. Дві повинки ембріонів в прозорій оболонці

Крім зберігання ембріонів методом культивування, розроблено метод довготермінового зберігання із застосуванням глибокого заморожування (кріоконсервування) в рідкому азоті при температурі - 196 °С.

Перевагою кріоконсервування являється тривале зберігання ембріонів, можливість їх транспортування і введення реципієнтам при необхідності (по мірі приходу реципієнтів спонтанно в охоту).

Заморожування ембріонів проводиться за допомогою автоматичних програмних приладів. Автоматичні програмні заморожувачі складаються із трьох основних частин: з електронного блоку, камери для заморожування і ємкості з рідким азотом. Як холодоагент використовуються пари рідкого азоту.

З вітчизняної апаратури для заморожування ембріонів використовується УОП-12 (Харків).

Для заморожування використовують свіжоотримані ембріони відмінний та доброї якості. Роботи по заморожуванню проводять в стерильному боксі з використанням стерильних реактивів, посуду і обладнання.

З метаю захисту ембріонів готують фосфатно-сольовий буфер (ФБС), до складу якого вводять 100000 од/л пеніциліну і 20 % сироватки крові. Концентрація кріопротектора – гліцерину складає від 1,0 М до 1,4 М. Починають насичувати ембріони з меншої концентрації, а готують кріопротектор, починаючи з більших концентрацій.

Насичення ембріонів гліцерином приводять при кімнатній температурі в малих чашках Петрі або на годинниковому склі, куди поміщають ембріони, що мають певну концентрацію. Ембріони відмінної якості можна насичувати в розчинах 1,0 або 1,4 концентрації гліцерину на протязі 30 хвилин без попередньої проводки. Підготовлені до заморожування ембріони переносять в скляні пробірки 50×6 мл або ампули місткістю 1 мл чи пластикові соломинки об'ємом 0,25 мл.

В кожну пробірку чи ампулу поміщають 1-4 ембріони одного донора в 0,3-0,4 мл розчину кріопротектора. В соломинках заморожують 1-2 ембріони. Заправку компонентів в соломинку проводять в такій послідовності: розчин гліцерину (2/5 об'єму), пухирець повітря, ембріони в 1,4 М розчині гліцерину (2/5 об'єму соломинки). Стовпчик розчину кріопротектора повинен доторкнутись до пижа в соломинці.

Пробірки з ембріонами закривають фольгою, скляні ампули за - паюють, соломинки закривають спеціальними пластиковими пробками. Ємкість маркірують і дані заносять в журнал.

Підготовлені ємкості з ембріонами поміщають у відповідне гніздо холодильної камери й охолоджують в режимі:

від +20 до -6°С зі швидкістю 1°С/хв; штучна кристалізація; від -6 °С до -35 °С зі швидкістю 0,3°С/хв; перенесення ембріонів в рідкий азот.

При використанні кріопротектора гліцерину в концентрації 1,0 М штучну кристалізацію проводять в межах від -5 °С до -6 °С, і в концентрації 1,4 М - від - 6 °С до - 7 °С.

Для кристалізації доторкуються до верхнього краю стовпчика середовища подалі від ембріону пінцетом або іншим металевим предметом, переохолодженим в рідкому азоті.

Ембріони зберігають в посудинах Дьюара типу X 34 Б місткістю 33 л в спеціальних каністрах із оргскла, фторопласту, а транспортують в посудинах Дьюара типу СДС-5 місткістю 5 л у вищезгаданих каністрах.

Розморожування ембріонів і підготовка їх до пересадки

Розморожування ембріонів проводять у водяній бані при температурі + 25°С або 37°С. Ємкість швидко витягують з каністри і опускають у водяну баню на 10-12 секунд до майже повного зникнення льоду. Під час розморожування ємкість поступово переміщують у воді маятникоподібними рухами.

Розморожені ембріони в краплі розчину переносять на годинникове скло і проводять попередню морфологічну оцінку якості, а потім проводять відмивку ембріонів від кріопротектора в послідовності від більшої до меншої концентрації.

Після закінчення терміну перебування ембріонів в останньому розчині гліцерину з найбільш слабкою концентрацією їх тричі промивають в свіжих порціях середовища ФБС + 20 % сироватки крові, а потім поміщають в це ж середовище на 10-20 хвилин. Ембріони сумнівної якості витримують в термостаті при 37 °С до 2 годин, з подальшою їх морфологічною оцінкою.

Інструментарій для пересадки ембріонів готується в боксі в стерильних умовах. Катетери-шприци стерилізують кип’ятінням на протязі 30 хв. і до початку роботи з ембріонами витримують в настільному боксі під бактерицидною лампою. Перед початком роботи з ембріонами вмикають бактерицидні лампи.

Соломинки заповнюють в такій послідовності: 1 см середовища (ФБС), 1 см повітря, 1 см середовища з ембріоном, 1 см повітря, 1 см середовища (ФБС) (рис. 21).

Соломинку вставляють в підігрітий до 37°С катетер для введення, поміщають в чохол, вставляють в контейнер і в горизонтальному положенні переносять до місця введення.

Пересадка і підсадка ембріонів реципієнтам

Пересадка від підсадки відрізняються тим, що в першому випадку ембріони вводять синхронізованому реципієнту, який не осіменявся паралельно з донором. Якщо ж реципієнта осіменяли одночасно з донором, то йому ембріони підсаджують в ріг матки, з боку якого в яєчнику немає жовтих тіл.

При хірургічній і не хірургічній пересадці та підсадці ембріонів їх намагаються помістити ближче до верхівок рогів матки.

Хірургічний метод потребує операційної практики, спеціальних приміщень, відповідного обладнання і інструментів. Цей метод дозволяє ввести ембріони глибоко в ріг матки, але він належить до полостних операцій, тому необхідно дотримуватись суворої стерильності, тварині наносяться травми при резекції, що не дозволяє використовувати реципієнта багаторазово. Ефективність хірургічної пересадки ембріонів становить 60-70%.

Перші досліди по не хірургічній пересадці ембріонів проведені на початку 60-х років. При цьому використовувались річні інструменти у вигляді трубок та катетерів.

Пересадка ембріонів не хірургічним способом нагадує метод штучного осіменіння з ректальною фіксацією шийки матки. Однак фактично пересадка значно складніша.

Якщо під час осіменіння шийка матки відкрита, слизові оболонки ; піхви гіперемовані і ослизнені, а цервікальний слиз володіє бактерицидними властивостями, то під час пересадки ембріонів шийка закрита, порожнина матки стерильна, слизові оболонки дуже чутливі, легкоранимі і бактерицидні властивості маткового секрету знижені. Все це необхідно враховувати при роботі, звертаючи особливу увагу на асепгику та майстерність техніка.

Підготовку реципієнта проводять таким чином: їх фіксують в станку або на місті в стійлі, миють теплою водою з милом зовнішні статеві органи, витирають серветкою і дезінфікують. Після цього роблять сакральну анестезію 2% розчином новокаїну 5-7 мл, а сильнозбудливим реципієнтам вводять внутрішньом'язево міорелаксант комбелен 0,5.

Розроблено багато пристроїв та катетерів для не хірургічної пересадки ембріонів Найбільш широке застосування знайшли катетери, які складаються з металевого тіла - трубки і поршня, за допомогою якого ембріон витискають з пайєти, а також захисних кожухів.

Перед початком роботи інструменти стерилізують кип'ятінням, висушують і зберігають в настільному боксі під бактерицидною лампою, яку вмикають перед початком роботи.

Перед введенням катетера в статеві шляхи його дезінфікують вставляють в наконечник катетера і приєднують до нього поршень, легко натискаючи на поршень, перевіряють, чи виходить крапля середовища з пайєти.

Назовні катетера надягають санітарний чохол і вводять катетер по верхньому склепінню піхви до шийки матки. Проривають санітарний чохол.

Далі вводять руку в пряму кишку, прощупують матку, визначають, в якому яєчнику знаходиться жовте тіло і під ректальним контролем направляють катетер; в шийку матки. Якщо катетер ввели в отвір шийки матки, то обережно вапнуємо її на катетер і проштовхуємо його в іпсілатералький жовтому тілу ріг матки. Обережними рухами вводять катетер якомога ближче до верхівки рогу матки, постійно контролюючи місце знаходження кінця катетера. Якщо катетер правильно введений, його повертають міткою до слизової оболонки і дають команду помічнику натискати на поршень, щоби ембріон з середовищем ввести матку.

Не рекомендується на протязі двох місяців після пересадки перегруповувати, вакцинувати та піддавати іншим стресовим факторам реципієнтів. Годівля реципієнтів повинна бути повноцінною, тому що низький рівень, незбалансованість раціону викликає порушення обміну речовин, репродуктивної функції і знижує приживлення ембріонів

Через 60 - 90 днів після пересадки ембріонів реципієнтів досліджують на тільність при допомозі ректального дослідження .

Рис. 24. Телята отримані методом трансплантації

Трансплантація ембріонів в різних видів сільськогосподарських тварин

У кролів трансплантацію ембріонів виконують хірургічним способом.

Синхронізації донора і реципієнта досягають шляхом одночасного осіменіння донора і провокуючим овуляцію коїтусом реципієнтів з вазектомованим кролем.

Можна провокувати овуляцію у реципієнтів також і внутрім'яовим введенням лютеїнізуючого гормону.

Через 3-4 дні після осіменіння, під загальним наркозом проводять лапаротомію по білій лінії черевної стінки, підраховують кількість жовтих тіл в яєчниках і вимивають з матки ембріони.

Техніка вимивання ембріонів така: у верхівку рога вводиться голка, приєднується до шприца з промивальною рідиною, потім пальцями або спеціальними зажимами стискають посередині ріг матки і вводять гумову або скляну канюлю поблизу місця стискання.

Промивальну рідину вводять шприцом в порожнину рога і одночасно відсмоктують її через канюлю. Зразу ж після вимивання з одного рога, проводять вимивання з другого, і одночасно ведуть пошук ембріонів. В разі невідповідності кількості жовтих тіл і знайдених ембріонів вимивання повторюють.

Після повного вимивання ембріонів матку донора промивають дезинфікуючим розчином або розчином антибіотиків, виймають канюлю і закривають ранову поверхню матки і черевної порожнини.

Одночасно проводять лапаротомію, реципієнта і оцінюють ембріони. Знайдені і оцінені ембріони в 1-1,5 мл промивальної рідини з сироваткою (фетальною) вводять у верхівки рогів, після чого черевну порожнину зашивають.

Повторне використання донора можливе після 2—3 повноцінних статевих циклів.

Після трансплантації вагітність визначають через 5- 6 днів рефлексологічним методом, в більш пізні строки - методом пальпації.

У овець трансплантацію ембріонів хірургічним способом виконують у всі періоди розвитку ембріонів до 12-13 дня і навіть в більш пізній час вагітності.

У свиней також використовують хірургічний спосіб, однак кращі результати досягаються при трансплантації 6-8-денних бластоцист.

У коней трансплантація ембріонів проводилась лише в експерименті нехірургічним способом.

Ветеринарно-санітарні правила роботи при трансплантації

В лабораторії і боксі, де працюють з ембріонами, а також в приміщенні для кріоконсервації та зберігання ембріонів мають право знаходитись тільки працюючі там співробітники.

Бокси для роботи з ембріонами повинні знезаражуватись на протязі 30 хв., з розрахунку 2-3 хв. на 1 м³ об'єму. Приміщення боксу не рідше одного разу в тиждень ретельно вимивають і протирають розчином 3 %-ного перекису водню з миючими засобами.

В день роботи з ембріонами столи протирають ватно-марлевими тампонами, які змочені в 96° етиловому cпирті.

Інструменти і посуд ретельно миють при допомозі щіток і йоржиків миючим порошком, промивають проточною водою і тричі дистильованою, висушують і стерилізують.

Стерилізація кип'ятінням проводиться на протязі 30 хв. після закипання води при закритій кришці стерилізатора.

Стерилізація сухим жаром проводиться в сушильних шафах, в яких розміщують сухі чисті скляні інструменти, посуд, що завернуті в пергаментний папір або фольгу для харчових цілей.

Доводять до температури +140 - +170°С і витримують 1-2 год., а потім дають охолонути.

Стерилізація в автоклаві (скляний посуд, металічні інструменти, халати та ін.) проводиться при 1,5 атм. на протязі 30 хвилин. Скляні та металеві предмети закривають пергаментним папером.

Хімічним методом стерилізують вироби з пластмаси, гуми тощо) проводиться використовують 70° спирт, 5 % розчин хлораміну на протязі 24 годин. Перед використанням інструменти 2-3 рази промивають дистильованою водою і фосфатно буферним середовищем.

Поверхню виробів із пластмаси і гуми можна також стерилізувати опроміненням лампи БУВ-30 на протязі 20 хв. на віддалі 30 см від джерела ультра фіолетового пристрою. При цьому треба мати на увазі, що промені не забезпечують повної стерилізації внутрішньої поверхні порожнинних предметів.

Облік та звітність при трансплантації ембріонів

Використання трансплантації ембріонів вимагає добре налагодженого первинного зоотехнічного та ветеринарного обліку на всіх етапах технологічною процесу

На кожну тварину донора і реципієнта заповнюється картка племінної матки (ф. 2 МОЛ, ф 2 СВ, ф. 2 ОКЗ) До цього додасться ветеринарне свідоцтво (форма №1) і довідка про стан здоров'я, відтворної здатності та інших показників згідно вимог до донорів.

Оперативний облік робіт, безпосередньо зв'язаний з технологією транс-плантації ембріонів, здійснюється за допомогою спеціальних карток донорів, реципієнтів та трансплантантів.

Картка донора і реципієнта заповнюється при відборі тварин на основі даних первинного зоотехнічного племінного обліку, клінічної і гінекологічної диспансеризації, а також при огляді і ректальному контролі статевих органів.

На плідників, сім'я яких використовувалось для осіменіння донорів, заповнюється картка (ф. 1 МОЛ, ф. 1 СВ, ф. 1 ОКЗ) або племсвідоцтво.

У картці відмічається використання кожного елементу технології трансплантації ембріонів.

Виявляють донора в охоті і осіменяють. Записують дату, час початку і закінчення охоти.

Ведеться облік і реєстрація робіт у робочих журналах: обліку використання донорів (додаток ), гормонального викликання поліовуляції у донорів; видобування, оцінки якості і використання ембріонів (додаток ); кріоконсервація і використання ембріона; облік (реєстрація) результатів пересадки ембріонів.

Трансплантація ембріонів реципієнтам