Стимуляція суперовуляції у донорів

 ТЕМА: 5. СТИМУЛЯЦІЯ СУПЕРОВУЛЯЦІЇ В ДОНОРІВ 

МЕТА ЗАНЯТТЯ : засвоїти основні принципи стимуляції суперовуляції в донорів і отримання від них ембріонів різними способами.

ЗАВДАННЯ: навчитись проводити стимуляцію суперовуляції, та отримувати ембріони за різних способів.

Стимуляція суперовуляції в донорів і їхнє запліднення. Для викликання множинного росту і дозрівання фолікулів у корів і телиць використовують різні гормональні препарати, що володіють фолікулостимулюючою активністю. Найчастіше використовують нативную сироватку жеребной кобили (СЖК) чи лиофилизированний гонадотропин СЖК (ГСЖК). Гонадотропну обробку починають за 2–3 дні до природної чи викликаний екзогенними гормонами регресії жовтого тіла, так, як уведення СЖК у лютеінову фазу циклу неефективно. Оскільки співвідношення фракцій фолликулостимулюючого (ФСГ) і лютеінізуючого гормону (ЛГ) у СЖК рідко буває оптимальним, а овуляція розтягнута, з метою її синхронізації додатково вводять людський хорионический гонадотропин (ХГ). Якщо ознаки полювання в корів, оброблених СЖК, уже помітні, ХГ уводятьвнутрішньовенно. Останнім часом замість СЖК усі частіше використовують ФСГ із гіпофіза свині, тому що при цьому одержують більш стабільні результати. Застосовується і комплексний препарат ФСГ із ЛГ (5:1)  ( http://ua-referat.com/Фізіологічні_основи_регуляції_статевої_функції_самок_сх_тварин_за_допомогою_біологічно_активних).

   Рис. 29  Реакція суперовуляції яєчника корови на обробку ФСГ

Результати такої стимуляції значно краще як за рівнем реакції суперовуляцією, так і, що особливо важливо, по кількості ембріонів, придатних для трансплантації.

Однак цей варіант гормональної обробки має й істотний недолік: необхідність багаторазових ін'єкцій унаслідок швидкого розпаду екзогенного ФСГ в організмі донора. Період його напіврозпаду складає близько 5 год, тому ФСГ уводять добовими дозами багаторазово: по 5 мг двічі в день протягом п'яти днів зменшуваними від 5 до 2 мг дозами. На відміну від ФСГ, гонадотропин СЖК довгостроково (до п'яти доби) циркулює в організмі обробленої тварини, унаслідок чого можна обмежитися однією ін'єкцією. Ін'єкція препарату в м'яз забезпечує ударність його дії, тоді як при підшкірному введенні усмоктування відбувається уповільнено, гонадотропин у міру його надходження в кров руйнується і необхідної його концентрації не створюється. У результаті реакція яєчників суперовуляцією розтягується в часі і не досягає потрібного рівня.

При стимуляції суперовуляції і синхронізації статевих циклів свиноматок як донорів використовують свинок напередодні статевої зрілості живою масою 70 – 80кг, свинок із повним статевим циклом, але вперше йдуть у злучку і, нарешті, свиноматок при відлученні поросят. Багаторазова лапаратомия стимульованих 6 – 7-місячних свинок показала, що через 36 год після ін'єкції ХГ овуляція в них має місце тільки в 16 % у результаті чого овулює 33  —38 фолікулів.

Через розтягнутість овуляції при гормональній стимуляції не можна обмежуватися 1- чи 2-кратним заплідненням. У більшості випадків корів-донорів осіменяють кожні 12 год протягом усієї охоти при використанні більших, ніж звичайно, доз сперми. Найкращі результати спостерігали при 4-кратному уведенні високоякісної сперми в одну охоту і збільшенні спермодози до 75 млн. сперміїв.

У літературі немає єдності думки по питанню про перевагу використання свіжої чи замороженої сперми. Безумовно, що при заплідненні замороженою спермою доцільно подвоювати дози.

 Техніка запліднення донорів. Донорів осіменяють, дотримуючи того ж правила асептики, що і при штучному заплідненні звичайних тварин. Рекомендується сперму вводити в краніальну частину шийки матки, застосовуючи ректо-, мано- чи візоцервікалъний способи запліднення. При цьому перевага віддається першому способу. Починати запліднення через 48...54 годин після введення простагландина. Використовувана сперма повинна мати активність не нижче 4 балів при температурі 38...40 °С, кожна доза повинна містити 10...15 млн активних спермиїв, а загальна доза - не менш 50 млн. Донорів осіменяют 3...4 рази з інтервалом 10...12 годин.

Рекомендується осіменять донорів, уводячи спочатку дві дози через 12 годин після настання охоти, потім ще три через 12 годин після першого запліднення, а якщо охота продовжується, ще одну — через 12 годин після другого запліднення.

Заплідненість  яйцеклітин донорів може бути різною в залежності від індивідуальних особливостей бика. У зв'язку з розтягнутістю суперовуляції і багаторазовим заплідненням донорів одержувані від них ембріони бувають різних стадій розвитку – від ранньої морули до пізньої бластоцисти, що не повинно бентежити фахівців. Якщо ці ембріони не мають ознак чи дегенерації, ушкоджень, вони придатні для пересадження.

Техніка вимивання ембріонів. Одержувати ембріони від донора можна хірургічним, або нехірургічним шляхом. Останній має переваги, що дозволяє використовувати донора багаторазово майже без зниження його відтворної здатності, потім вимивання можна здійснювати на фермі без спеціальної фіксації тварини. На 6 – 8 день у корів у матку переходить 73%, ембріонів, тому промивання її можливе не раніше 5 – 6-го дня після запліднення. Обов'язкова умова при цьому – відкритий канал шийки матки і строге дотримання стерильності.

  Рис. 30  Схема розташування катетера в розі матки корови при нехірургічному витягу ембріонів.

Після встановлення наявності жовтих тіл у потенційного донора його бажано на добу позбавити корму, щоб забезпечити асептичні умови роботи. Також рекомендують позбавити тварина на цей же термін води, однак останнє, як нам здається, небажано через винекненнясильний стрес у донора, що може відбитися на життєздатності ембріонів, що знаходяться на критичній стадії розвитку. Зовнішністатеві органи перед вимиванням ембріонів обмивають і дезінфікують після чого роблять низьку сакральну эпидуральную анестезію ксилокаином (4—6 мол 2%-ного розчину) чи медокаином, прокаином (8-10 мол 2%-ного розчину) чи новокаїном (5—7 мол 1,5%-ного розчину).

Закордонні автори рекомендують застосовувати попередньо (за 20 хв до початку процедури) седативні засоби – 0,3 – 0,5 мол ксилазина внутрішньомязево  чи ацетпромазина. Недопустиме забруднення ембріонів сечею донора, тому що при цьому вони втрачають здатність до розвитку.

Підготовлений пристрій для вимивання ембріонів уводять через шийку матки за допомогою твердого стилета, потім стилет витягають, а пристрій фіксують у розі надувним балоном (мал. 2). Кінець пристрою будь-якої конструкції повинний знаходитися у верхівці рога. Перші 10 - 20 мл змиву добирають в окремий посуд, тому що наявні в цій порції слиз і кров не тільки заважають виявленню ембріонів, але і дуже шкідливо на них впливають. Ріг при промиванні дуже ніжно масажують і погойдують зі сторони убік для кращого змиву ембріонів. Промивають ріг матки 5—8 разів, використовуючи підігрітий до 37,5 - 38°С фосфатний буфер Дюльбекко (ФБС) з додаванням 1% плодової сироватки теляти (ПСТ). Промивну рідину збирають у змінні конічні посудини, оскільки практично всі ембріони виявляють у перших 3—4 змивах, а в наступних лише одиничні. Для перегляду під мікроскопом беруть 3—4 мл середовища з дна судини. Після, вимивання в матку вводять розчин антибіотиків для асептики 30 мл 20%-ного розчину люголя для запобігання тільності. Простагландин кращий, тому що він сприяє найшвидшому розсмоктуванню множинних жовтих тіл і нормалізації статевого циклу донора.

Рекомендується більшістю експериментаторів 20-хвилинне відстоювання промивної рідини як на кобилах, так і на коровах може знижувати вихід трансплантантів унаслідок негативного впливу на ембріони витягнутої з матки рідини. Краще використовувати прийом дрібно-фракційного збору першої порції рідини при безупинній подачі її в матку. Дуже полегшує збір ембріонів швидке обертання в одному напрямку конічної посудини, вільно встановленого в штативі вертикально: це прискорює осідання ембріонів на денце конуса і попереджає осідання їх на стінках судини.

При хірургічному вимиванні ембріонів проводять передопераційну підготовку тварин, при цьому звільняють кишечник від калових мас, видаляють забруднення з поверхні тіла, зістригають вовну. При операції застосовують загальний наркоз. Обов'язкова наявність обладнаної операційної і дотримання строгої стерильності.

Перевагою цього методу є точність оцінки стану репродуктивного тракту донора і реакції яєчників суперовуляцією на гормональну обробку, малий обсяг промивної рідини, і отже, менша травма эндометрия при кращих результатах вимивання. Негативна сторона полягає в трудомісткості і дорожнечі процедури, що вимагає професійних знань, небезпеки операційних ускладнень при застосуванні загального наркозу і виникненні спайок і фляків у післяопераційний період, що обмежують повторність використання донора.

ПИТАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ:

1.            Як проводять стимуляцію суперовуляції в донорів та їхнє запліднення.

2.            Техніка запліднення донорів.

3.            Техніка вимивання ембріонів.