Глибоке заморожування і тривале збереження ембріонів

ТЕМА 6.   ГЛИБОКЕ ЗАМОРОЖУВАННЯ І ТРИВАЛЕ ЗБЕРЕЖЕННЯ ЕМБРІОНІВ

МЕТА ЗАНЯТТЯ: вивчити методику заморожування ембріонів при повільному режимі  та шляхом  прямого занурення в рідкий азот.

ЗАВДАННЯ: проведення заморожування ембріонів за різних способів.

Заморожування ембріонів при повільному режимі

Для криоконсервації ембріонів технологія передбачає використання як традиційного методу заморожування, так і прямого занурення в рідкий азот.

При замерзанні ембріонів у їхній протоплазмі утвориться багато льоду, що може бути причиною або механічного руйнування внутрішньоклітинних органелу і цитоплазматичної мембрани, або осмотичного шоку в результаті  кристалізації або рекристалізації внутрішньоклітинної води.

Видалення води з клітин проводиться в діапазоні субнулевих температур. Під час кристалоутворення зростає концентрація позаклітинних розчинів, вода всередині клітки спрямовується з клітки через цитоплазматичну мембрану, що веде до зневоднення бластомерів; при подальшому заморожуванні великі кристали всередині клітин уже не утворюються.

До даного часу вперше описаний, метод модифікований, але його основні вимоги залишилися незмінними: присутність проникаючих кріопротекторів у процесі охолодження; ініціація (посів) кристалізації льоду при температурах нижче точки замерзання середовища, що заморожується; повільне охолодження (0,3 ^оС/хв.), що закінчується при -40 ⁰С; наступне занурення і збереження в рідкому азоті.

Технологічний регламент використання повільного режиму заморожування передбачає наступне.

Коли всі ембріони від одного донора виявлені й оцінені, їх підготовляють до кріоконсервації, не очікуючи закінчення робіт із змивами від інших донорів. Перед заморожуванням ембріони насичують гліцерином, використовуючи 1,2 М розчин гліцерину в 20 % розчині ФС у ФСБ або СФСБ. Для готування такого розчину в асептичних умовах до 1,1 м гліцерину додають 9,12 мл 20 % ФС у ФСБ. Гліцерин розфасовують перед роботою по 1,1 г в 10 мл або 20 мл стерильні флакони, закривають пробками і парафіном і зберігають до вживання в холодильнику. Насичення ембріонів гліцерином проводять в одну ступінь при кімнатній температурі. Для цього ембріони від одного донора із дотриманням правил асептики переносять у чашку Петрі діаметром 40 мм із 1,2 М розчином гліцерину на 7 хвилин. Процес насичення варто контролювати під мікроскопом. При цьому зміна об'єму зародка (швидке початкове зменшення об'єму бластомерів і більш повільне відновлення початкового об'єму при незмінних розмірах зони пеллюцида) свідчить про цілісність мембранного апарата зародка.

Насичені гліцерином зародки розфасовують у пайєтти для заморожування і пересадження. При цьому набір середовищ проводять у наступному порядку: 0,75 М розчин сахарози в 20 % розчині ФС у ФСБ, повітряний пухирець 2...3 мм; ембріон у 1М розчині гліцерину в 20 % розчині ФС у ФСБ, повітряний пухирець 3... 5 мм; простір, що залишився, пайєтти заповнюють 0,75 М розчином сахарози в 20 % розчині ФС у ФСБ.

При заправленні ембріона в пайєтту необхідно стежити, щоб середовище з гліцерином знаходилось від краю пайетти з пробкою на відстані 66±3 мм.

Для приготування 0,75 М розчину сахарози до 2,7 мл її доливають 5 мл 20 % розчину ФС у ФСБ і розчиняють, перемішуючи вміст скляною паличкою. Після цього загальний обсяг розчину доводять до 10 мол. Для зручності сахарозу заздалегідь розфасовують по 2,7 г в стерильні флакони, що мають поділку для об'єму 10 мл.

Прилад для заморожування ембріонів складається із сосуда Дьюара, контейнера для пайєтт, штатива для кріплення контейнера на горловині сосуда Дьюара і термопар для розміщення програми охолодження.

Пайєтти з ембріонами розміщають у контейнері для заморожування і опускають в горловину сосуда Дьюара. Термоізоляційні властивості контейнера забезпечують одержання оптимального режиму спаду температури.

Відтають - переносячи пайєтту з каністри сосуда Дьюара у водяну лазню кімнатної температури (20...22 °С).

Після відтаювання вміст пайєтти перемішують струшуванням. При цьому середовище в пайєттах повинна переміщатися в сторону пробки.

Через 5 хвилин після змішування середовищ ембріони оцінюють мікроскопічне через прозору стінку плоскої пайєтти. Якщо ж ембріони поміщені у французькі пайєтти, у який не представляється можливим оцінити ембріон через стінку, їхній вміст виливають у чашку Петрі і досліджують під мікроскопом. Для пересадження придатні непошкоджені ембріони, що мають нормальну морфологічну структуру. Можливо також використання ембріонів з незначними ушкодженнями — розриви одного або декількох бластомерів, незначні руйнування зони пеллюцида.

Після відтавання зародки необхідно використовувати протягом 2 годин.

Кріоконсервация ембріонів шляхом прямого занурення в рідкий азот

Технологічний регламент по використанню швидкісного методу заморожування ембріонів передбачає наступне. Для приготування еквілібраційного і заморожуючого середовища повинні бути використані тільки високоякісні СФСБ, ФСБ, ФС, гліцерин і сахароза. Усі роботи проводять при кімнатній температурі з дотриманням правил асептики.

Краплю (150...300 мл) розчину, (10 % гліцерину на 20 % ФС у ФСБ) поміщають у чашку Петрі. За допомогою полімерної або скляної піпетки, кінець якої відтягнуть до об'єму 200...400 мл, ембріони переносять у цю краплю і витримують 10 хвилин. При цьому можна спостерігати осмотичну реакцію: спочатку ембріони спливають у розчині, їхня цитоплазма стискується, потім до кінця 5...7-ї хвилини ембріони приймають початкову форму і осідають на дно.

Розчин для заморожування готують змішуючи 30 % гліцерину і 70 % 1 М сахарози, приготовленої на живильному ( середовищі 20 % ФС на ФСБ). Краплю розчину для заморожування (150...300 мл) поміщають у чашку Петрі за допомогою описаної вище піпетки. Ембріон, що пройшов стадію 10-хвилинної еквілібрації, переносять у розчин для заморожування і заправляють у соломину; об'ємом 0,25 мл.

Під час змочування пробки з полівінілового спирту в процесі зарядки ембріона в соломину потрібно домогтися максимально можливого просочення пробки рідиною. У противному випадку під час занурення в рідкий азот останній попадає в простір між полівініловою і целюлозною частинами пробки і надалі це приводить до її вистрілювання. Після цього соломину закривають промартільною пробкою і погружають у рідкий азот.

Спочатку ту частину, у якій знаходиться заморожуюче середовище, а потім — частина соломини разом із пробкою.

Під час перебування ембріона в розчині для заморожування можна спостерігати яскраво виражену осмотичну реакцію. Зона пеллюцида і цитоплазма ембріона приймають форму еритроцита. Це свідчить про інтенсивні дегідратаїдонні процеси.

Відтаювання ембріонів проводять у водяній лазні при 40 °С на протязі 5 секунд. При цьому щоб уникнути вистрілювання полівінілової пробки під час занурення соломини у водяну лазню її після виймання з рідкого азоту до занурення у воду витримують на повітрі 3...4 секунди. Потім ножицями відтинають полівінілову пробку, попередньо протерши місце відсікання 70 % етиловим , спиртом, і з боку відсікання видувають середовище, що заморожується, з ембріонами в краплями (150...300 мл) 1 М розчин сахарози, приготовленого на живильному середовищі (20 % ФС на ФСБ або СФСБ).

Видалення криопротектора проводиться протягом 7 хвилин. Осадження ембріонів на дно чашки Петрі свідчить про максимально можливе видалення гліцерину з бластомерів.

Після цього ембріони переносять у живильне, середовище заправляють у соломину, як описано вище, і пересаджують реципієнтам.

Методика виконання  Підготовка до розморожування сперми

Для здійснення процесу розморожування сперми необхідно мати:

- термостат біологічний ТБ-010 або прилад “Росинка”; термометр спиртовий на +50 ^оС; термометр ртутний медицинський; стерильний, в ампулах, 2,9% розчин цитрату натрію; пінцет анатомічний довжиною 25-30 см; ножиці прямі; рукавиці або стерильну салфетку 30х30 см; тампони ватні спиртові.

У ванночку термостату ТБ-010 наливають 600-700 мл дистильованої води, включають в електромережу і нагрівають до +38 ^оС. Технологічна температура термостата настає через 30-40 хв після включення 

Якщо на пункті або в спец автомобілі-лабораторії є прилад “Росинка” для розморожування сперми у формі гранул, його підключають через перетворювач електротоку БП-1 до електромережі; а в автомобілі – прямо до акумулятора. Через 8-10 хв в приладі створюється технологічна температура        +38 ^оС (±0,5 ^оС) і він готовий для проведення розморожування сперми 

Ампулу з 2,9%-ним розчином цитрату натрію беруть в ліву руку, роблять надріз склорізом в області шийки ампули, знезаражують поверхню тампоном, змоченим спиртом в 96 ^оС. шийку ампули відбивають, ампулу з розчином 2,9%-ного цитрату натрію ставлять в гніздо штативу ТБ-010 або приладу “Росинка”. В ТБ-010 є гнізда різного діаметру: по центру і краях гнізда – з малим діаметром, сюди вміщується ампула цитрату натрію. Для ампул діаметром готуються диски із гумової камери діаметром, який трохи перевищує велике гніздо ТБ-010. В центрі диска роблять надріз, насаджують диск на ампулу і ставлять в гніздо. У приладі “Росинка” є три гнізда для черкаського і 3 гнізда для білоруського цитрату натрію в ампулах.
 Розчин цитрату натрію нагрівається до температури + 38^оС протягом 2-3 хвилин.

 Розморожування сперми

Після підготовки приступають до діставання сперми із посудини Д’юара. Для цього технік надіває захисні окуляри і рукавиці, після чого каністру, тубу або контейнер (стакан) із замороженою спермою переміщує в нижню третину горловини посудини. Забороняється піднімати упаковку із спермою вище середини горловини. Технік дістає одну дозу сперми стерильним, охолодженим до –196 ^оС пінцетом, швидко переносить її в підготовлену для розморожування ампулу з цитратом натрію. Гранули по 0,1 мл розморожують 8-10 сек., а об’ємом 0,2 мл – 18-30 сек.

 Для прискореного розморожування сперми в гранулах ампулу, у якій розморожують сперму, треба пальцями руки енергійно обертати навколо її вісі, не піднімаючи її з термостата.

Для розморожування сперми в соломинках і облицьованих гранулах штатив ТБ-010 виймають. Соломинку (пайету) дістають із упаковки з посудини Д’юара пінцетом, струшують для видалення залишків зрідженого азоту і занурюють в воду ТБ-010.

Упаковку (каністру, тубу, стаканчик) з спермою зразу занурюють в посудину Д’юара для подальшого зберігання.

При відсутності в каністрі, тубі або контейнері (стакані) із спермою зрідженого азоту, не можна їх тримати в горловині, це призведе до підвищення температури замороженої сперми і зниженню рухливості сперміїв при подальшому розморожуванні.

Відтаювання соломинок (пайет) за французькою технологією (об’єм дози 0,5 мл) триває до 1 хв., а мінітюби за технологією ФРН-8-10 сек.

При розморожуванні сперми в облицьованих гранулах тривалість відтаювання – 8-10 сек. – до появи тонкого стержня льоду.

Після відтаювання соломинку або облицьовану гранулу виймають із води, протирають її стерильною марлевою серветкою, кладуть на стіл – на другу знезаражену серветку або рушничок. Облицьовану гранулу обов’язково треба перевірити на герметичність, здавлюючи її між пальцями.

  Сперму після розморожування необхідно використати якомога швидше, тобто протягом 10-15 хвилин.

Розморожену сперму обов’язково оцінюють за рухливістю сперміїв. 

ПИТАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ

1.     Як відбувається заморожування ембріонів при повільному режимі;

2.     Кріоконсервация ембріонів шляхом прямого занурення в рідкий азот;

3.     Методика розморожування сперми.