Отримання, оцінка та маніпуляція з ембріонами

 ТЕМА 7.  ОТРИМАННЯ ОЦІНКА ТА МАНІПУЛЯЦІЯ З ЕМБРІОНАМИ

мета занняття : Засвоїти основи отримання, оцінки та маніпуляцій з ембріонами.

ЗАВДАННЯ: проведення маніпуляцій з ембріонами.

Температура в лабораторії для роботи із ембріонами повинна бути 20...25^оС. За три година до початку роботи приміщення обробляють ультрафіолетовими променями за допомогою бактерицидних ламп, що встановлюють із розрахунку 1 Вт на 1 м³. Приймальні ємності підвішують на спеціальному лабораторному штативі для седиментації і обробляють 70° спиртом. Тривалість осідання ембріонів - 15...20 хвилин.

По закінченню седиментації нижню частину приймальної ємності (ембріоприймальник) пережимають термозажимом і ножицями відтинають від прийомної ємності. Через прозору стінку ембріоприймальника роблять підрахунок ембріонів і їхню попередню оцінку під мікроскопом. При необхідності, наприклад якщо вимивання ембріонів проводилося в польових умовах у пересувній лабораторії, ембріоприймальник з ембріонами транспортують. Якщо транспортування ембріонів займає більш 2 годин, ембріоприймальник прохолоджують до 0°С зануренням у лід, що тане. При 0°С ембріони можуть зберігатися в ембріоприймальнику до 48 годин.

При витяганні ембріонів з ембріоприймальника його нижню частину, незаповнену середовищем, відрізають ножицями так, щоб до середовища залишалося не менше 1 мм. Потім середовище з ембріонами видавлюють у чашку Петрі діаметром 90 мм. Пошук ембріонів, а також інші маніпуляції проводять під мікроскопом МБС-9 або МБС-10 під збільшенням 14 або 28 (1х14 або 2х14). Для пошуку ембріонів у слизі використовують гістологічні голки. Усі роботи з відкритими ембріонами ведуть на столі ламінарної шафи, в яку постійно подається стерильне повітря, що дозволяє запобігти мікробній контамінації.

Виявлені ембріони пересаджують пастерівською піпеткою або 1 мл шприцом з полімерною голкою в чашку Петрі діаметром

40 мм. Як середовище для короткострокового збереження ембріонів при кімнатній температурі використовують 20% розчин фетальної сироватки (ФС) у фосфатно-сольовому буфері Дюльбекко чи СФБ. Необхідно стежити, щоб при перенесені зародків не виникали пухирці повітря. При цьому капіляр пастерівської піпетки або голку шприца цілком заповнюють середовищем. Для заморожування, короткострокового збереження, мікрохірургії і пересадження використовують ембріони гарної і відмінної якості. Оцінку їх проводять при збільшенні в 100—200 разів по загальноприйнятих методиках на мікроскопах МБИ-15, МБИ-13, МР-13, МР-17 і ін. При цьому контролюють стан зони пеллюціда, рівномірність розміщення бластомерів, відсутність зернистості в цитоплазмі, характер умісту перивителлінового простору, відповідність стадії розвитку ембріона його віку й ін.

Повноцінні ембріони мають кулясту форму, не ушкоджену прозору оболонку, однакові бластомери з чіткою плазматичною оболонкою і світлою гомогенною цитоплазмою.

Кількість бластомерів у зародка, що розвивається, щодоби подвоюється і на 4...7-й день вони досягають стадії ранньої морули, на 7...8-й день -ранньої, а на 9.,. 10-й пізньої бластоцисти. На 10... 11-у добу ембріон виходить із прозорої оболонки.

П.Кауффольд, И.Тамм, И.Ф.Шихов і ін. (1990) дають найбільш розгорнуту систему оцінки ембріонів, що ми рекомендуємо використовувати при практичному застосуванні методу овотрансплантації.

Після оцінки придатні до використання ембріони тричі відмивають стерильним 20 % розчином ФС у ФСБ. Цю операцію проводять, послідовно пересаджуючи ембріони з краплі в краплю. При всіх маніпуляціях контролюють кількість ембріонів, чіткість ідентифікації, маркірують чашки Петрі т.п. Після виконання описаних вище маніпуляцій придатні для трансплантації ембріони розфасовують у пайєтти і використовують при пересадженні. Нами (Осташко й ін., 1988) розроблена конструкція і налагоджено випуск плоских пайєтт, що забезпечують гарну видимість ембріона під мікроскопом. Кожну пайетту маркірують за допомогою полімерних пробок нашої конструкції. Усі дані про ембріон фіксують у відповідному журналі.

Інтервал часу між одержанням зародка і початком наступного технологічного етапу (короткострокового збереження, криоконсервації) не повинний перевищувати двох годин.

КОРОТКОСТРОКОВЕ ЗБЕРЕЖЕННЯ ЕМБРІОНІВ

Короткострокове збереження доцільне, якщо синхронізація між стадією розвитку ембріона і статевим циклом реципієнта не перевищує 1,5 доби.

Для короткострокового збереження ембріон заправляють у пайєтту в такий спосіб: набирають 20% розчин ФС у ФСБ або СФСБ на довжину 30...45 мм, потім повітряний пухирець на 5...10 мм, 20% розчин ФС у ФСБ (на 20... 30 мм) з ембріоном, знову повітряний пухирець — 5... 10 мм і простір, що залишився, заповнюють 20% розчином ФС у ФСБ. Для заправлення середовища й ембріона використовують 1 мл полімерний шприц, що з'єднують з пайєттою за допомогою полімерної трубки. Забір ембріона в пайєтту проводять під мікроскопічним контролем.

Пайєтти з ембріонами поміщають у поліетиленову трубку діаметром 3,8 мм і герметизують за допомогою термозажиму або приладу "Блискавка".

Для збереження ембріонів при 0°С використовують крижану лазню, змішуючи потовчений лід з дистильованою водою в співвідношенні 1:1. Як ємність використовують побутовий термос. При 0°С можливо збереження зародків протягом двох діб.

Перед використанням паєтти виймають із крижаної лазні, витягають з поліетиленового чохла і заправляють в інструмент для пересадження. З часу вилучення паєтти з крижаної лазні до пересадження не повинно проходити більш двох годин. У наших дослідженнях (Осташко, Песоцкий, 1990) після пересадження 64 ембріонів, що зберігалися при температурі 0°С, прижилося 32 (50 %).

МІКРОХІРУРГІЧНИЙ ПОДІЛ ЕМБРІОНІВ

У практиці роботи зі штучного запліднення корів і теличок з метою збільшення кількості одержуваних нащадків від високопродуктивних тварин встановлена можливість мікрохірургічного поділу ембріонів на дві половинки, а іноді навіть на чотири частини. Доведено, що з частин ембріона, що прижилися, розвиваються цілком повноцінні нащадки.

До поділу допускаються свіжовилучені що зберігалися при 0°С або деконсервіруванні ембріони гарної і відмінної якості на стадії морули, ранньої, що розширюється і розширеної бластоцисти. Перед поділом ембріони пересаджують у краплю 20% розчину ФС у ФСБ на предметному склі і поміщають під мікроскоп.

Поділ проводять скляною голкою в площині симетрії зародка шляхом роздвоєння бластомерів при повільному натисненні голкою на зародки. Нами розроблений спосіб мікрохірургічних операцій на яйцеклітинах і ембріонах (Осташко, Безуглий, Гордиенко, 1990), що відрізняється тим, що з метою підвищення схоронності об'єкта і технологічності операції (виймання ембріонів із прозорої оболонки, пересадження бластомерів, розподіл на частини і т.п.) виконуються в гіпертонічному розчині непроникаючих речовин з концентрацією 1,2...1,5 М в біологічно повноцінному середовищі. При цьому ембріон стискується усередині  зони, що полегшує мікроманіпуляції при його поділі. Для пересадження використовують половинки зародка, що поміщають у паєтти відразу після поділу. Більш високий рівень приживлення розділених ембріонів досягається при попередньому розміщенні їх у порожні прозорі оболонки, що заготовлюють заздалегідь.

ГЛИБОКЕ ЗАМОРОЖУВАННЯ І ТРИВАЛЕ ЗБЕРЕЖЕННЯ ЕМБРІОНІВ

Заморожування ембріонів в повільному режимі

Для криоконсервації ембріонів технологія передбачає використання як традиційного методу заморожування, так і прямого занурення в рідкий азот.

При замерзанні ембріонів у їхній протоплазмі утвориться багато льоду, що може бути причиною або механічного руйнування внутрішньоклітинних органелу і цитоплазматичної мембрани, або осмотичного шоку в результаті кристалізації або рекристалізації внутрішньоклітинної води.

Видалення води з клітин проводиться в діапазоні субнулевих температур. Під час кристалоутворення зростає концентрація позаклітинних розчинів, вода всередині клітки спрямовується з клітки через цитоплазматичну мембрану, що веде до зневоднення бластомерів; при подальшому заморожуванні великі кристали всередині клітин уже не утворюються.

До даного часу вперше описаний, (1972) метод модифікований, але його основні вимоги залишилися незмінними: присутність проникаючих кріопротекторів у процесі охолодження; ініціація (посів) кристалізації льоду при температурах нижче точки замерзання середовища, що заморожується; повільне охолодження (0,3 с/хв), що закінчується при –40 С; наступне занурення і збереження в рідкому азоті.

Технологічний регламент використання повільного режиму заморожування передбачає наступне.

Коли всі ембріони від одного донора виявлені й оцінені, їх підготовляють до кріоконсерваціі, не очікуючи закінчення робіт із змивами від інших донорів. Перед заморожуванням ембріони насичують гліцерином, використовуючи 1,2 М розчин гліцерину в 20% розчині ФС у ФСБ або СФСБ. Для готування такого розчину в асептичних умовах до 1,1 м гліцерину додають 9,12 мол 20% ФС у ФСБ. Гліцерин розфасовують перед роботою по 1,1г в 10 мл або 20 мл стерильні флакони, закривають пробками і парафіном і зберігають до вживання в холодильнику. Насичення ембріонів гліцерином проводять в одну ступінь при кімнатній температурі. Для цього ембріони від одного донора із дотриманням правил асептики переносять у чашку Петрі діаметром 40 мм із 1,2 М розчином гліцерину на 7 хвилин. Процес насичення варто контролювати під мікроскопом. При цьому зміна об'єму зародка (швидке початкове зменшення об'єму бластомерів і більш повільне відновлення початкового об'єму при незмінних розмірах зони пеллюцида) свідчить про цілісність мембранного апарата зародка.

Насичені гліцерином зародки розфасовують у пайєтти для заморожування і пересадження. При цьому набір середовищ проводять у наступному порядку: 0,75 М розчин сахарози в 20% розчині ФС у ФСБ, повітряний пухирець 2...3 мм; ембріон у1М розчині гліцерину в 20% розчині ФС у ФСБ, повітряний пухирець 3... 5 мм; простір, що залишився, пайєтти заповнюють 0,75 М розчином сахарози в 20% розчині ФС у ФСБ.

При заправленні ембріона в пайєтту необхідно стежити, щоб середовище з гліцерином знаходилось від краю пайєтти з пробкою на відстані 66±3 мм.

Для приготування 0,75 М розчину сахарози до 2,7 м її доливають 5 мл 20% розчину ФС у ФСБ і розчиняють, перемішуючи вміст скляною паличкою. Після цього загальний обсяг розчину доводять до 10 мол. Для зручності сахарозу заздалегідь розфасовують по 2,7 г в стерильні флакони, що мають поділку для об'єму 10 мл.

Прилад для заморожування ембріонів складається із сосуда Дьюара, контейнера для пайєтт, штатива для кріплення контейнера на горловині сосуда Дьюара і термопар для розміщення програми охолодження.

Пайєтти з ембріонами розміщають у контейнері для заморожування і опускають в горловину сосуда Дьюара. Термоізоляційні властивості контейнера забезпечують одержання оптимального режиму спаду температури.

Перевозять ембріони в транспортних сосудах Дьюара "ХТ-35" або "X-5".

Відтають - переносячи пайєтту з каністри сосуда Дьюара у водяну лазню кімнатної температури (20...22 °С).

Після відтаювання вміст пайєтти перемішують струшуванням. При цьому середовище в пайєттах повинна переміщатися в сторону пробки.

Через 5 хвилин після змішування середовищ ембріони оцінюють мікроскопічне через прозору стінку плоскої пайєтти. Якщо ж ембріони поміщені у французькі пайєтти, у який не представляється можливим оцінити ембріон через стінку, їхній вміст виливають у чашку Петрі і досліджують під мікроскопом. Для пересадження придатні непошкоджені ембріони, що мають нормальну морфологічну структуру. Можливо також використання ембріонів з незначними ушкодженнями — розриви одного або декількох бластомерів, незначні руйнування зони пеллюцида.

Після розморожування зародки необхідно використовувати протягом 2 годин.

Кріоконсервація ембріонів шляхом прямого занурення в рідкий азот

Технологічний регламент по використанню швидкісного методу заморожування ембріонів передбачає наступне (Грищенко й ін., 1992; Осташко та ін., 1994).

Для приготування еквілібраціонного і заморожуючого середовища повинні бути використаю тільки високоякісні СФСБ, ФСБ, ФС, гліцерин і сахароза. Усі роботи проводять при кімнатній температурі з дотриманням правил асептики.

Краплю (150...300 мл) розчину, (10% гліцерину на 20% ФС у ФСБ) поміщають у чашку Петрі. За допомогою полімерної або скляної піпетки, кінець якої відтягнуть до об'єму 200...400 мл, ембріони переносять у цю краплю і витримують 10 хвилин. При цьому можна спостерігати осмотичну реакцію: спочатку ембріони спливають у розчині, їхня цитоплазма стискується, потім до кінця 5...7-й хвилини ембріони приймають початкову форму і осідають на дно.

Розчин для заморожування готують змішуючи 30% гліцерину і 70% 1М сахарози, приготовленої на живильному (середовищі 20% ФС на ФСБ). Краплю розчину для заморожування (150...300 мол) поміщають у чашку Петрі за допомогою описаної вище піпетки. Ембріон, що пройшов стадію 10-хвилинної еквілібрації, переносять у розчин для заморожування і заправляють у соломину; об'ємом 0,25 мл.

Під час змочування пробки з полівінілового спирту в процесі зарядки ембріона в соломину потрібно домогтися максимально можливого просочення пробки рідиною. У противному випадку під час занурення в рідкий азот останній попадає в простір між полівініловою і целюлозною частинами пробки і надалі це приводить до її вистрілювання. Після цього соломину закривають промартільною пробкою і погружають у рідкий азот.

Спочатку ту частину, у якій знаходиться заморожуюче середовище, а потім – частина соломини разом із пробкою.

Під час перебування ембріона в розчині для заморожування можна спостерігати яскраво виражену осмотичну реакцію. Зона пеллюцида і цитоплазма ембріона приймають форму еритроцита. Це свідчить про інтенсивні дегідратаїдонні процеси.

Розморожування ембріонів проводять у водяній лазні при 40 °С на протязі 5 секунд. При цьому щоб уникнути вистрілювання полівінілової пробки під час занурення соломини у водяну лазню її після виймання з рідкого азоту до занурення у воду витримують на повітрі 3...4 секунди. Потім ножицями відтинають полівінілову пробку, попередньо протерши місце відсікання 70% етиловим , спиртом, і з боку відсікання видувають середовище, що заморожується, з ембріонами в краплями (150...300 мл) 1М розчин сахарози, приготовленого на живильному середовищі (20% ФС на ФСБ або СФСБ).

Видалення кріопротектора проводиться протягом 7 хвилин. Осадження ембріонів на дно чашки Петрі свідчить про максимально можливе видалення гліцерину з бластомерів.

Після цього ембріони переносять у живильне середовище, заправляють у соломину, як описано вище, і пересаджують реципієнтам.

ПИТАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ:

 1. Методика  короткострокового збереження ембріонів

2. Техніка проведення мікрохірургічного поділу ембріонів

3. Глибоке заморожування і тривале збереження ембріонів